在細胞生物學、腫瘤學、藥理學等領域的研究中，細胞功能檢測是揭示細胞生理狀態、病理機制及藥物作用效果的核心手段。細胞周期、增殖、活性、缺氧狀態、活性氧水平及耗氧率等指標，從不同維度反映了細胞的代謝活性、生長狀態及應激反應。本文將系統梳理這六種關鍵檢測技術的原理、操作要點及應用場景，為科研工作者提供全面的技術參考。?
一、細胞周期檢測?
細胞周期是細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，包括 G1 期、S 期、G2 期和 M 期，其進程異常與腫瘤發生、細胞分化障礙等疾病密切相關。?
(一)檢測原理?
常用碘化丙啶(PI)染色法，PI 可嵌入 DNA 雙鏈中，其熒光強度與 DNA 含量成正比。通過流式細胞儀分析熒光信號，可將處于不同周期時相的細胞區分開：G1 期細胞含二倍體 DNA，熒光強度呈單峰；S 期細胞處于 DNA 合成階段，熒光強度介于 G1 期和 G2/M 期之間；G2/M 期細胞含四倍體 DNA，熒光強度為 G1 期的兩倍。?
(二)操作要點?
樣品制備：收集對數期細胞，用 PBS 洗滌 2 次，加入 70% 冰乙醇固定，4℃孵育過夜。?
染色處理：離心去除固定液，PBS 洗滌后，加入 PI 染色液(含 RNase A，避免 RNA 干擾)，室溫避光孵育 30 分鐘。?
檢測分析：通過流式細胞儀檢測，采用 ModFit 軟件分析各周期時相細胞的比例。?
(三)應用場景?
主要用于研究細胞增殖調控機制、腫瘤細胞周期阻滯藥物的篩選，以及細胞分化過程中周期進程的變化。?
二、細胞增殖檢測?
細胞增殖檢測用于評估細胞的生長能力，是判斷細胞活力、藥物細胞毒性及生長因子作用效果的重要指標。?
(一)常用方法及原理?
CCK-8 法：CCK-8 試劑中的 WST-8 在細胞內脫氫酶作用下生成橙色甲臜染料，染料產量與活細胞數量成正比，通過酶標儀檢測 450nm 處吸光度值，反映細胞增殖水平。?
EdU 摻入法：EdU 是胸腺嘧啶類似物，可在 S 期摻入新合成的 DNA 中，通過熒光標記的 EdU 抗體檢測熒光信號，直接反映處于增殖期的細胞比例。?
(二)操作要點?
CCK-8 法：將細胞接種于 96 孔板，培養至設定時間點，加入 CCK-8 試劑，繼續孵育 1-4 小時，檢測吸光度值。需設置空白對照組，排除試劑本身的吸光干擾。?
EdU 摻入法：細胞培養時加入 EdU 工作液，孵育 2-24 小時(根據細胞周期調整)，固定細胞后進行通透處理，加入熒光標記抗體孵育，熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀定量。?
(三)應用場景?
廣泛應用于藥物篩選(評估藥物對細胞增殖的抑制或促進作用)、細胞毒性檢測、干細胞增殖能力評估等領域。?
三、細胞活性檢測?
細胞活性檢測旨在判斷細胞的存活狀態，區分活細胞與死細胞，常用于評估實驗處理對細胞的損傷程度。?
(一)核心方法及原理?
臺盼藍染色法：臺盼藍是細胞活性染料，活細胞細胞膜完整，染料無法進入；死細胞細胞膜破裂，染料進入后使細胞呈藍色，通過顯微鏡計數活細胞與死細胞比例。?
鈣黃綠素 - AM / 碘化丙啶(Calcein-AM/PI)雙染色法：Calcein-AM 可被活細胞內的酯酶水解生成綠色熒光物質，PI 僅能進入死細胞染色 DNA 呈紅色，通過熒光顯微鏡或流式細胞儀同時區分活細胞和死細胞。?
(二)操作要點?
臺盼藍染色法：取細胞懸液與臺盼藍染液按比例混合，室溫靜置 5 分鐘，顯微鏡下計數 200 個以上細胞，計算活細胞率。?
雙染色法：細胞接種于培養皿或 96 孔板，加入染色液孵育 15-30 分鐘，避光條件下觀察熒光信號，綠色熒光為活細胞，紅色熒光為死細胞。?
(三)應用場景?
適用于細胞培養過程中的活力監測、藥物或毒素對細胞的損傷評估、細胞分離純化后的活性檢測等。?
四、細胞缺氧檢測?
細胞缺氧是多種生理和病理過程中的重要微環境特征，如腫瘤組織、缺血性疾病病灶等，缺氧檢測可精準反映細胞所處的氧環境狀態。?
(一)檢測原理?
采用缺氧特異性探針(如 pimonidazole hydrochloride)，該探針在缺氧條件下(氧分壓 < 10mmHg)可被細胞內的還原酶還原，生成能與細胞內蛋白結合的產物，通過免疫熒光或免疫組織化學方法檢測結合產物，即可標記缺氧細胞。?
(二)操作要點?
細胞水平檢測：將缺氧探針加入細胞培養液，在設定的缺氧條件下培養 2-4 小時，固定細胞后進行通透處理，加入熒光標記的特異性抗體孵育，熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀定量。?
組織水平檢測：將探針通過尾靜脈注射入動物體內，一段時間后取目標組織，制作石蠟切片，通過免疫組化染色檢測缺氧區域。?
(三)應用場景?
主要用于腫瘤微環境研究、缺血性心臟病及腦卒中的病理機制探討，以及缺氧靶向藥物的研發與效果評估。?
五、活性氧檢測?
活性氧(ROS)是細胞代謝過程中產生的含氧活性物質，過量 ROS 會導致氧化應激損傷，與衰老、腫瘤、神經退行性疾病等密切相關。?
(一)檢測原理?
利用 ROS 特異性熒光探針(如 DCFH-DA、DHE)，探針進入細胞后，被 ROS 氧化生成具有熒光活性的物質，熒光強度與 ROS 水平正相關。DCFH-DA 可檢測總 ROS，DHE 主要檢測超氧陰離子。?
(二)操作要點?
細胞接種于培養板，培養至對數期，加入熒光探針工作液，37℃孵育 20-30 分鐘。?
用 PBS 洗滌細胞 3 次，去除未進入細胞的游離探針，加入新鮮培養液，通過熒光顯微鏡觀察熒光強度，或用酶標儀 / 流式細胞儀定量檢測。?
(三)應用場景?
適用于氧化應激相關疾病的機制研究、抗氧化藥物的篩選與效果評估、環境毒素對細胞的氧化損傷檢測等。?
六、耗氧率檢測?
耗氧率是反映細胞線粒體呼吸功能的核心指標，直接體現細胞的能量代謝水平，對研究線粒體功能障礙相關疾病具有重要意義。?
(一)檢測原理?
采用 Seahorse XF 細胞能量代謝分析儀，該設備通過檢測細胞培養液中氧氣濃度的實時變化，計算細胞的耗氧率。儀器配備專用培養板，可在不干擾細胞培養的情況下進行動態監測。?
(二)操作要點?
細胞接種于 Seahorse 專用培養板，培養至細胞融合度達 70%-80%，更換為無血清無碳酸氫鹽的檢測培養液，37℃無 CO?環境下平衡 1 小時。?
設定檢測程序，加入線粒體呼吸鏈抑制劑(如寡霉素、 FCCP、抗霉素 A 等)，通過分析抑制劑作用前后的耗氧率變化，區分基礎耗氧率、ATP 耦合耗氧率及最大耗氧率。?
(三)應用場景?
常用于線粒體功能評估、代謝相關疾病(如糖尿病、肥胖癥)的機制研究、藥物對細胞代謝的調控作用分析等。
